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      实验技巧┃石蜡切片技术的前前后后,你确定都了解?

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      从今天起小编将会不定时像大家分享一些分子实验室常用的实验技巧,之前我们有分享过关于细胞培养、RNA提取、qPCR常见问题等内容干干干干货!为什么你提取的RNA总是被降解?师姐心血之作 | 成功培养细胞的技巧都在这里了老司机带你轻松玩转qPCR,问题、异常统统搞定!点击链接即可跳转至内容,今天呢我们分享的主要内容是关于石蜡切片相关实验的一些注意事项和技巧。

      石蜡切片技术的发展方便了很多科研人员对样本的需求,通过石蜡包埋的样本可以保存数年,并且对保存环境要求不严格,这对于科研人员来说是极大的便利。石蜡包埋的原理是新鲜的样本组织,通过石蜡处理,将石蜡代替了组织中的水分,从而制成切片,并能良好的保存组织和细胞的结构。石蜡切片前期制作较为复杂,包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋┉┉封片等步骤,较为繁琐

      具体实验步骤:

       

      取材

      根据不同的实验目的,选择相应的样本,及时放入盛有固定液体的标本瓶中,组织要求新鲜,搁置时间过久则产生蛋白质分解变性,导致细胞自溶及细菌的滋生,而不能反映组织活体时的形态结构。

       

      固定

      固定液的种类很多,其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。固定液的用量一般为材料的10~15倍或稍多,常规固定时间为12~48h(根据组织块大小而定),固定能使组织硬化,有利于后续实验顺利进行。

       

      洗涤与脱水

      固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀,否则会影响后期的染色效果,可以用流水冲洗数小时,使用酒精或就是混合液固定的材料,不需要洗涤,可直接进入脱水环节,脱水是为了因为水和透明剂不互溶,用酒精脱水后可让透明剂进入组织,可用70%、85%、95%、100%浓度的乙醇进行脱水,脱水时间根据组织快大小而定,一般1-2小时,如果不能及时进行梯度脱水,要将组织放入70%的乙醇中保存。

       

      透明

      酒精和石蜡不互溶,用二甲苯替换出组织内的酒精。用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等,各种透明剂均是石蜡的溶剂,可先用一半的无水乙醇和一半二甲苯混合液浸渍,在换成二甲苯两次共40min~2h(根据组织块大小而定)。

       

      浸蜡与包埋

      是为了让石蜡浸入组织替代透明剂,起支持作用,以便包埋。将熔化蜡倒人包埋盒,用温镊子夹取组织块放入盒的中央位置,待石蜡全部凝结变硬即可取出。

       

      修切蜡块

      把包埋好的蜡块用刀片修切成正方形或长方形,注意勿太靠近组织,让组织四周留有少许石蜡,蜡块两边必须切成平行的直线,以免切下的蜡条弯曲。

       

      固定蜡块

      取小木块,用蜡铲在酒精灯上加热,使石蜡块底面熔化一层粘于小木块上,冷却后装在切片机上。

       

      载玻片

      取干净的载玻片涂以甘油蛋白:以玻璃棒尖端稍取甘油蛋白一滴,轻轻滴于载玻片中央,常以洗净的手指加以涂布,涂布的面不宜太广,而以恰恰能够贴附蜡片为度。甘油蛋白不能涂布过多,否则,会形成白膜,妨碍观察。

       

      切片

      注意刀的倾角,切片厚度一般为5-8μm用毛笔托住蜡带,放在展片盒内(水温宜在48°C左右)展片,刀片的锋利度与石蜡块的软硬直接影响切片质量。

       

      贴片

      蜡带受热即自动展开,也可用拨针轻轻拉开。待蜡片完全展平后,用滤纸吸去多余水分。注意切片和载玻片之间不能有气泡,否则在展片时气泡会扩大,甚至致使切片破损、变形,影响组织观察。

       

      烤片

      将贴片置人37~62℃恒温干燥箱干燥12h。干燥后片子常温、阴凉处保存待实验时用。

       

      以上是关于石蜡切片的相关技术操作,其实在实验中,石蜡切片技术是不容易掌握的,经常会由于一些未知的因素导致切片质量差,影响后续实验,所以下面小编将在切片过程中常见的一些问题及解决方法大致罗列一下,希望对大家的科研有所帮助。

       
       

      end

       

       


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